近幾十年來，光片熒光顯微鏡作為熒光顯微技術的一種革新，顯著提升了生命科學研究中對組織與細胞結構和功能的高時空分辨率成像能力。

相較于傳統(tǒng)的落射熒光顯微技術，光片顯微鏡通過選擇性逐層照明生物樣本，大大提高了光子利用效率，降低了光毒性，并顯著提升了成像速度。光片顯微鏡問世以來，其在生命科學研究中的應用范圍逐漸拓寬，從胚胎學、神經科學到腫瘤研究等多個領域均有所涉及，不僅可用于觀察細胞和組織的基本結構，還可用于實時監(jiān)測生物過程中的動態(tài)變化。同時，其跨尺度的特點使其適用于從宏觀到微觀的多個尺度上的觀察。

華中科技大學周瑤、費鵬團隊發(fā)表文章綜述了光片顯微鏡在高通量成像、分辨成像以及易用性方面的應用及發(fā)展，旨在為生命科學研究人員提供全面的了解和參考，推動光片顯微鏡在更多領域的應用和發(fā)展。

光片顯微鏡在高通量成像中的應用及發(fā)展

一、面臨的挑戰(zhàn)

在腦科學研究和腫瘤病理學診斷中，對大樣本進行三維顯微成像至關重要，但傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡通量有限，處理大型樣本時圖像采集時間長，且提升分辨率會降低信噪比。光片顯微鏡雖有優(yōu)勢，但高斯光片顯微鏡存在視野與光片厚度的矛盾，難以平衡大視野照明探測和微米級三維分辨率。

二、技術改進與發(fā)展

1、軸向掃描技術

2015年，Dean等提出使用音圈電機、電動可調諧透鏡等電動部件沿傳播方向掃描高斯光片，配合科研級CMOS相機電子卷簾狹縫掃描，擴大了瑞利范圍，提高了成像通量，但對激發(fā)光功率要求高且會造成額外光漂白。以mesoSPIM和ctASLM為代表，將此項技術應用于大組織成像取得了*成果。

2、平鋪拼接光片技術

2015年，Gao等開發(fā)了平鋪拼接光片熒光顯微技術，利用鐵電液晶空間光調制器控制光片移動，拍攝小視場高分辨圖像后拼接，實現(xiàn)大視場高軸向分辨率成像，但同步掃描方式存在光漂白等問題。

3、貝塞爾光片技術

貝塞爾光片是實現(xiàn)大樣本三維高通量成像的利器，其具有較強自愈性和抗散射能力，干涉可用范圍優(yōu)于高斯光片。2010年，F(xiàn)ahrbach等提出將無衍射的貝塞爾光束與光片技術結合的思想，發(fā)明了自愈光束顯微技術，但貝塞爾光片旁瓣影響軸向分辨率?？茖W西安光學精密機械研究所姚保利研究員團隊和華中科技大學費鵬教授團隊分別采用不同方法抑制旁瓣，實現(xiàn)了對小鼠大腦的高通量三維成像。2020年，Zhao等將深度神經網絡與光片顯微鏡結合提升了分辨率，2021年，F(xiàn)ang等將掃描貝塞爾光片顯微鏡與內容感知壓縮傳感計算方法結合，大幅提升了分辨率和光學通量。

光片顯微鏡在高通量成像中的發(fā)展

光片顯微鏡在分辨成像中的應用及發(fā)展

一、分辨技術原理及局限

光學顯微鏡受衍射極限限制，分辨顯微成像技術雖提高了空間分辨率，但在時間分辨率及光毒性方面存在問題，限制了對生物結構的精細三維長時程觀察。分辨熒光顯微鏡根據成像原理分為基于頻譜調制、光激活、抑制點擴散函數(shù)邊緣、熒光漲落原理等類型。

二、光片顯微鏡與分辨技術結合的成果

1、選擇性照明結合結構光照明顯微鏡

2014年，Chen等提出晶格光片熒光顯微（LLSFM）技術，將結構光照明與光片顯微成像技術結合，實現(xiàn)了150nm分辨率成像，但光晶格無法多角度旋轉，只能在橫平面一個方向實現(xiàn)分辨。2017年，Chang等提出相干結構照明光片熒光顯微技術（csiLSFM），通過改變光束傳播方向旋轉條紋結構光光場，在橫平面各方向實現(xiàn)分辨，將空間分辨率提高到100nm，但結構光照明提高分辨率倍數(shù)有限。

2、選擇性照明結合單分子定位顯微鏡

2011年，Zanacchi等首次將單分子定位分辨技術引入光片熒光顯微成像，提高了圖像信噪比，在厚散射樣本中實現(xiàn)單分子納米級定位和三維活細胞分辨成像，分辨率達60nm。2019 年，Kim等提出單分子斜平面分辨顯微鏡（obSTORM），擴大了單分子定位系統(tǒng)軸向范圍，展示了多種樣本深度達66μm 的分辨率成像。

3、選擇性照明結合STED顯微鏡

2011年，F(xiàn)riedrich等將選擇平面顯微技術與STED相結合，發(fā)揮了STED成像速度快和光片顯微成像深度深、光強低的優(yōu)點，提高了軸向分辨率，實現(xiàn)對厚活體生物快速高分辨成像，打破了STED只能用于組織表面成像的限制。

4、選擇性照明結合計算分辨成像

2016年，Chen等提出雙光子分辨率光片成像（2PLS-SOFI），基于波動/閃爍探針的非線性激勵開發(fā)了相關顯微鏡，提高了空間和時間分辨率。2020年，Chen等改進貝葉斯分辨技術，提高了數(shù)據處理速度。2022年，Zhao等提出漸進式深度學分辨率策略與雙環(huán)調制選擇性平面照明顯微鏡設計結合，以100nm各向同性空間分辨率可視化活細胞內結構動態(tài)數(shù)小時，揭示了細胞內結構關系和相互作用。

光片顯微鏡在分辨成像中的應用

光片顯微鏡在易用性方面的發(fā)展

一、早期結構限制

早期光片成像系統(tǒng)照明與探測光路垂直，雙物鏡限制了樣本類型和應用。在許多應用中，傳統(tǒng)光片系統(tǒng)因樣本夾持或生物體結構遮擋無法從正交方向成像，且在微流控芯片、玻片和96孔板中樣本大規(guī)模成像受限。對于高倍率成像，物鏡工作距離短，傳統(tǒng)樣本承載方式難以實現(xiàn)成像，且樣本數(shù)量規(guī)模難以提升。

光片顯微鏡的典型模態(tài)

二、改進措施及成果

1、斜置開頂式光片技術

2015年，Huang等使用特定物鏡組合與傾斜玻片構成樣品腔，補償像差，實現(xiàn)了對微流控通道和96孔板中多種生物樣本的高通量成像。Jonathan課題組對倒置開頂式光片系統(tǒng)進行一系列技術改進，包括設計SIL拓展應用、用SIMlens代替SIL校正像差、提出緊湊型可變分辨率倒置開頂式顯微鏡并證明其實用性。

2、單物鏡光片顯微成像技術

2008年，Dunsby提出斜平面顯微鏡（OPM），采用離軸激發(fā)和遠程聚焦技術，單物鏡負責光片激發(fā)和熒光信號采集。2015年，Bouchard等提出掃描、共焦對齊平面激發(fā)（SCAPE）顯微鏡，實現(xiàn)多類樣本快速、溫和、高分辨率三維活體成像，但遠程成像模塊導致成像性能損失。2019年，Yang等將遠程聚焦物鏡換為水鏡提升收光能力，2022年，Yang等提出DaXi技術，使用定制高質量高數(shù)值孔徑遠程聚焦物鏡，實現(xiàn)幾乎不損失分辨率的三維高速成像。然而，單物鏡光片顯微鏡存在數(shù)值孔徑、像差、倍率切換等問題，目前更適用于單一高倍率系統(tǒng)。

結與展望

單物鏡光片顯微鏡雖在兼容性上有所拓展，但仍存在不少缺陷。大視野成像時，受技術原理與結構限制，面臨諸多難題，如光線傳播與光場分布不均，致使難以獲取大視野清晰圖像。其像差校正極為復雜，照明與探測光路斜交產生像差，現(xiàn)用三物鏡遠程聚焦法雖能校正，但系統(tǒng)復雜、成本高、穩(wěn)定性低且易受環(huán)境影響，對*人員依賴度高。倍率切換也困難重重，遠程聚焦使探測光路復雜，物鏡光學參數(shù)受限，無法像共聚焦顯微鏡那樣原位自由變倍，嚴重影響研究效率。因此，目前在中低倍情況下分辨率較差，無法滿足多種研究需求。

展望未來，期待*直接探測光片顯微成像系統(tǒng)。它要大幅提升探測分辨率，*呈現(xiàn)樣本細節(jié)；提高熒光收集效率，增強成像靈敏度與對比度；解決倍率切換問題，實現(xiàn)便捷原位變倍，兼具良好成像性能；達成對多種樣本高通量、高分辨、智能化三維成像分析，涵蓋單細胞到大型組織。若能實現(xiàn)，光片顯微鏡將融合高性能、通用性與易用性，成為下一代熒光顯微成像關鍵技術，有力推動多領域發(fā)展。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：周瑤, 費鵬. 光片熒光顯微成像技術的發(fā)展及應用（特邀）[J]. 激光與光電子學進展, 2024, 61(6): 0618019. Yao Zhou, Peng Fei. Development and Application of Light Sheet Fluorescence Microscopy Technology (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618019.