在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加酶結(jié)合物和顯色劑后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。

一、溫育的時(shí)間選擇

溫育這一步是ELISA測定中*容易出現(xiàn)問題的步驟。目前國內(nèi)ELISA試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘-1小時(shí)，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1-2小時(shí)才能有較完全的結(jié)合，低于1小時(shí)，可能會(huì)影響測定下限。

ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有*貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)是需要一定時(shí)間的溫育。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。

二、溫育的溫度選擇

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。

在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中*，以形成*多的沉淀。但因所需時(shí)間太長，在ELISA中一般不予采用。