高時空分辨可視化技術是腦科學研究的重要工具。熒光顯微成像技術在特異性、多樣性、圖像對比度和時空分辨率等方面具有顯著優(yōu)勢，但由于光在組織中的穿透深度有限，無創(chuàng)的熒光成像難以在活體水平獲取深層腦區(qū)神經血管單元的高分辨結構和功能信息。

因此，在腦科學研究中，熒光內窺顯微成像技術受到越來越多研究者的青睞。得益于相關科學技術的發(fā)展，內窺鏡探頭在保持高性能的同時，實現(xiàn)了小型化并提供了更大的靈活性，可以植入活體大腦的不同深度處，開展特定深層腦區(qū)的功能調控研究。

深圳大學物理與光電工程學林方睿團隊發(fā)表綜述文章，介紹了基于梯度折射率透鏡和單根多模光纖這兩種探頭的植入式熒光內窺顯微成像技術及其發(fā)展和迭代進程，概述了它們在高分辨活體腦成像研究中的應用，以及在臨床神經外科手術中的初步探索性應用。*，展望了熒光內窺腦成像技術未來的發(fā)展前景。

研究背景

一、腦科學研究的重要性及相關計劃

腦科學研究在前沿學科中占據關鍵地位，Science雜志與上海交通大學聯(lián)合公布的125個*前沿科學問題中有16個與腦科學領域相關。歐盟、美國、日本和澳大利亞等陸續(xù)開啟腦科學研究計劃，“腦計劃”于2016年全面布局，明確了“一體兩翼”發(fā)展戰(zhàn)略，北京和上海也相繼成立腦科學與類腦研究中心，2021年“腦計劃”正式啟動。腦科學研究不僅有助于探索未知大腦機制，還能為腦疾病尋找*診斷方案和治療策略。

二、大腦的工作原理及神經血管單元（NVU）的重要性

大腦通過神經元細胞間的生物電信號傳導發(fā)揮調控功能，腦血管為神經元網絡提供氧氣和營養(yǎng)并清除代謝產物。NVU由神經元、血管、膠質細胞、血腦屏障和細胞外基質構成，會產生與大腦健康和疾病相關的各種功能反應，如調節(jié)血腦屏障通透性、血管生成、血流動力學反應、神經炎癥和干細胞活性等。在活體水平獲取NVU結構和功能信息對腦科學研究至關重要，需要高時空分辨可視化技術。

三、現(xiàn)有腦影像技術的不足與熒光顯微成像技術的優(yōu)勢及局限

臨床腦影像技術如計算機斷層掃描成像、磁共振成像、正電子發(fā)射斷層成像等，空間分辨率為微米至亞毫米量級且耗時較長，難以滿足活體NVU成像需求。熒光顯微成像技術在研究目標的特異性和多樣性、圖像對比度和時空分辨率等方面有顯著優(yōu)勢，但由于光在組織中的穿透深度有限，無創(chuàng)熒光成像難以獲取深層腦區(qū)NVU的高分辨結構和功能信息。近紅外成像更適合活體應用，但傳統(tǒng)熒光成像技術成像深度局限于腦表層至淺層海馬區(qū)，無法覆蓋深層腦區(qū)。因此，研究人員將目光轉向內窺鏡技術，期望通過植入微型探頭的熒光內窺鏡開展活體深層腦功能調控研究。

小鼠顱骨、皮膚以及大腦皮層（新鮮組織）對不同波長光的衰減系數(shù)

植入式熒光內窺顯微成像技術

基于GRIN透鏡的

植入式內窺活體腦成像

一、GRIN透鏡的特性及在活體腦成像中的應用方式

GRIN透鏡折射率沿徑向漸變，使出射光線會聚成衍射極限光斑，具有直徑?。ㄍǔＰ∮?mm）、結構簡單、裝配方便、成本低和NA相對較大（不小于0.5）等優(yōu)點。在活體腦成像中，常將其作為植入式內窺探頭，與普通顯微鏡或微型顯微鏡配合，增加工作距離，實現(xiàn)對深層NVU的高時空分辨內窺成像。不過，成像時需吸除目標腦區(qū)上層組織，且可能造成出血和炎癥反應，因此目前主要用于嚙齒類動物模型研究，實驗通常在植入3-4周后進行，以降低炎癥影響并進行長期觀測。

二、基于GRIN透鏡的成像技術在腦科學研究中的具體應用

1、血流動力學與腦疾病研究

Jung等利用熒光素鈉標記血漿，通過寬場顯微成像記錄小鼠和大鼠海馬體單個紅細胞在毛細血管中的流動，發(fā)現(xiàn)腦部微血管血流速度減慢與神經退行性疾病有關，為深層腦區(qū)血流動力學檢測提供新方向。

Barretto等對原位膠質瘤小鼠模型進行長期熒光內窺成像，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長時周圍毛細血管直徑擴大但血流速度降低，正常血管形態(tài)和錐體神經元結構穩(wěn)定，這有助于理解腦膠質瘤微環(huán)境重塑，展示了長期熒光內窺技術在腦病模型研究中的價值。

GRIN透鏡植入后的長期活體內窺腦成像研究

2、神經元調控行為機制研究

用于研究眶額皮層神經元調控食物攝取行為、內側杏仁核神經元調控社交行為以及前內側丘腦神經元調控長期記憶等不同腦區(qū)神經元調控動物行為機制。

三、GRIN透鏡成像技術的優(yōu)化與發(fā)展

1、像差補償方法

商用GRIN透鏡存在像差，可通過多種方法校正。如增加平凸微透鏡、黏合帶有負球差的蓋玻片或在蓋玻片上3D打印非球面微透鏡，也可采用自適應光學（AO）技術，如加州大學Ji教授團隊將HiLo顯微技術引入寬場內窺系統(tǒng)，利用AO校正模塊補償像差，提高了成像性能。

補償GRIN透鏡內窺成像系統(tǒng)像差的方法及成像結果

2、與雙光子成像技術結合

雙光子成像與GRIN透鏡結合可實現(xiàn)高分辨率軸掃描，無需移動透鏡，且飛秒脈沖光在GRIN透鏡中色散小。Webb團隊驗證了其可行性，后續(xù)研究通過多種方法提高成像性能，如Moretti 等用SLM調制光場實現(xiàn)多焦點或圖案照明，Meng等將高斯光束調制成貝塞爾光束提高體成像速度，香港科技大學瞿佳男教授團隊提出AO校正策略提升縱向深度分辨率，并利用快速電調諧透鏡實現(xiàn)多平面Ca2+信號同時成像。

雙光子熒光顯微鏡與GRIN透鏡結合的活體內窺腦成像研究

3、微型顯微鏡的應用

微型顯微鏡質量輕，可在小動物自由活動時獲取NVU成像數(shù)據。將GRIN透鏡嵌入微型顯微鏡可實現(xiàn)內窺腦成像，如Flusberg等設計的微型雙光子內窺顯微鏡可實現(xiàn)海馬體以下約80μm的血管成像，Grewe等將GRIN透鏡與微型顯微鏡結合長期觀測神經元Ca2+響應，Barbera等在微型內窺顯微鏡中添加可變焦液體透鏡研究不同深度神經元信號傳導。

基于微型顯微鏡的GRIN透鏡活體內窺神經元功能成像

4、多區(qū)域成像方法

為研究跨腦區(qū)神經元關聯(lián)性，發(fā)展了多種低成本成像方法。如Yang等設計的MATRIEX技術，通過多個GRIN透鏡實現(xiàn)不同腦區(qū)神經元集群功能成像；Pochechuev等和Toader等將光纖束與GRIN透鏡裝配進行內窺腦成像，研究不同腦區(qū)神經元集群關聯(lián)性，揭示了長期記憶鞏固受丘腦-皮層回路調控等機制。

基于MATRIEX技術的多腦區(qū)神經元內窺成像

基于單根多模光纖的

植入式內窺活體腦成像

一、多模光纖的特點及在活體內窺腦成像中的原理

多模光纖能傳播多個光學模式，信息傳輸帶寬大，直徑極小（50-125μm），插入腦組織時對周邊神經元傷害小，可實現(xiàn)極微創(chuàng)內窺腦成像。但不同光學模式在光纖中傳輸時存在模式色散、干涉和耦合，形成光學散斑，限制了其在高分辨率圖像傳輸和活體成像中的應用?；诙嗄９饫w的高分辨率內窺成像通過傳輸矩陣測量和波前整形實現(xiàn)，利用光學調制器件調控光纖輸出光場，傳輸矩陣控制入射波前實現(xiàn)光斑掃描，成像系統(tǒng)還包括光場調制、熒光成像、相機和參考光校正模塊。

光束經過散射介質之后的重聚焦調控研究

幾種賦予多模光纖成像動態(tài)校準能力的方法

二、多模光纖成像技術的發(fā)展歷程及性能提升措施

1、早期研究與思路驗證

多模光纖成像方法雖早有報道，但早期受光纖加工工藝和工作環(huán)境影響，成像質量不佳。2010年Popoff等的研究為高分辨成像提供思路，后續(xù)Bianchi等、Cizmar等不斷改進，提高了成像速度和分辨率。

2、抗干擾與校準方法

為克服外界干擾，提出多種方法，如引入虛擬信標、在光纖遠端加工部分反射器、表面結構或引導星，以及利用深度學算法實現(xiàn)動態(tài)校準，如卷積神經網絡（CNN）等模型的應用。

三、多模光纖成像技術在活體腦成像中的應用成果

1、SLM調制成像

2018年Vasquez-Lopez等采用SLM調制實現(xiàn)活體大鼠背側紋狀體腦區(qū)神經元三維成像，對腦組織損傷小，還可通過SLM隨機掃描研究Ca2+信號動態(tài)監(jiān)測，研究活體大鼠丘腦區(qū)接受聲音刺激后的Ca2+響應。

基于SLM調制的多模光纖內窺腦成像

2、DMD調制成像

DMD調制速率高，Turtaev等搭建的DMD多模光纖內窺成像系統(tǒng)實現(xiàn)了較高成像速度和分辨率，可對視覺皮層和海馬體深層神經元進行動態(tài)成像；Shay等設計的雙色成像系統(tǒng)可捕捉快速傳導的Ca2+信號；Silveira等改進的側視多模光纖實現(xiàn)了貫穿全腦的神經元功能成像，浙江大學劉旭教授團隊的技術實現(xiàn)了傳輸矩陣實時校準，推動了多模光纖內窺成像技術的臨床應用。

基于DMD調制的多模光纖內窺腦成像

 側視多模光纖在活體腦成像中的應用研究

熒光內窺腦成像技術

在臨床上的應用

一、在腦腫瘤術中診斷的具體應用及優(yōu)勢

活體熒光內窺腦成像技術在小動物模型中成果顯著，在臨床腦腫瘤術中實時診斷方面發(fā)揮重要作用。神經外科醫(yī)生借助帶有手持式探頭的內窺鏡顯微鏡和熒光示蹤劑（如熒光素、吲哚菁綠和5-氨基乙酰丙酸等），可在微觀尺度上檢查腦組織中的腫瘤殘余，改善手術治療效果。如Charalampaki等展示了熒光內窺成像技術在腦膜瘤手術中的應用，Irakliy等搭建的術中遠程病理學軟件平臺可實現(xiàn)高效術中決策。

內窺腦成像技術在臨床腦腫瘤診斷中的應用

二、熒光壽命顯微成像（FLIM）在臨床腦腫瘤手術中的探索性應用

FLIM利用組織熒光壽命差異提供高對比度圖像，在臨床腦腫瘤手術中有初步探索性應用，可輔助無標記識別腫瘤組織。加州大學Marcu教授團隊將FLIM內窺系統(tǒng)與手術顯微鏡集成，通過監(jiān)測熒光壽命輔助醫(yī)生優(yōu)化手術方案，實現(xiàn)大面積腦腫瘤組織術中篩查。

結與展望

植入式熒光內窺顯微成像技術在腦科學研究中發(fā)揮重要作用，已實現(xiàn)深層腦區(qū)的在體顯微成像。GRIN透鏡是常用光學元件，具有多種優(yōu)勢，適用于活體深層神經元集群功能和血流動力學研究；單根多模光纖成像技術雖新，但在特定需求研究中具有優(yōu)勢?？裳兄颇Ｊ礁€(wěn)定、抗干擾能力強的多模光纖；采用精細3D打印技術在多模光纖端面上加工透鏡組，優(yōu)化成像分辨率、景深和視場；增加熒光偏振和熒光壽命成像模態(tài)，解析神經元生理信息。隨著相關技術發(fā)展，熒光內窺腦成像技術將取得新突破，推動腦科學研究，助力疾病治療與預防。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：林方睿, 張晨爽, 連曉倩, 屈軍樂. 植入式熒光內窺顯微技術及其在活體腦成像中的應用（特邀）[J]. 激光, 2024, 51(1): 0107001. Fangrui Lin, Chenshuang Zhang, Xiaoqian Lian, Junle Qu. Implantable Fluorescence Endoscopic Microscopy and Its Application in In Vivo Brain Imaging (Invited)[J]. Chinese Journal of Lasers, 2024, 51(1): 0107001.