酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作（二）

1：再每個(gè)EP管中加入150ul標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，更換槍頭后在1號(hào)管中加入150ul標(biāo)準(zhǔn)品。更換槍頭并將EP管用混勻儀混勻5秒

2：在1號(hào)管中吸取150ul加入2號(hào)管中，更換槍頭并將EP管用混勻儀混勻5秒。在2管中吸取150ul加入到3號(hào)管中，以此類(lèi)推

3：【加樣】：移液器調(diào)至50ul，標(biāo)準(zhǔn)品每個(gè)濃度點(diǎn)2個(gè)孔，每孔加入50ul。（加樣過(guò)程中注意更換槍頭)多道移液器調(diào)至40ul，樣本孔中每孔加入40ul樣本稀釋液；更換10ul移液器和槍頭，樣本孔中每孔加入10ul樣本（空白孔中不加入任何液體）（上海軒澤康生物溫馨提示：加樣時(shí)間盡量控制在15分鐘之內(nèi)完成，避免造成前后孔反應(yīng)時(shí)差。）

4：【孵育及洗滌）：封上封板膜并輕輕搖晃酶標(biāo)板，標(biāo)記項(xiàng)目及時(shí)間后置入37℃恒溫箱中孵育30分鐘。孵育結(jié)束后取出酶標(biāo)板。

5：【洗滌】：將洗滌液倒入容器中，小心揭掉封板膜。棄去液體并在吸水紙上拍干。準(zhǔn)備200ul多道移液器，每孔加200ul洗滌液，靜置30秒后棄去液體。重復(fù)洗滌、靜置、棄液步驟5次并拍干酶標(biāo)板。

6：【加酶】：每孔加入酶標(biāo)試劑50ul（空白孔除外），封上封板膜并輕輕搖晃酶標(biāo)板，標(biāo)記項(xiàng)目及時(shí)間后置入37℃恒溫箱中孵育30分鐘，孵育結(jié)束后取出酶標(biāo)板。小心揭掉封板膜，棄去液體。

7：【洗滌】：每孔加200ul洗滌液，靜置30秒后棄去。重復(fù)洗滌、靜置、棄液步驟5次。在吸水紙上拍干剩余液體。

8：【顯色】：將底物A、B分別倒入容器中.每孔加入50ul底物A,更換槍頭后每孔加入50ul底物B。封上封板膜并輕輕搖晃酶標(biāo)板，標(biāo)記項(xiàng)目及時(shí)間后置入37℃恒溫箱中避光孵育10分鐘.孵育結(jié)束后取出酶標(biāo)板。小心揭掉封板膜。

此時(shí)酶標(biāo)板應(yīng)有成梯度的可見(jiàn)色差

9：【終止】：終止液倒入容器中，每孔加終止液50ul進(jìn)行終止反應(yīng)。此時(shí)酶標(biāo)板內(nèi)液體由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，輕輕搖晃酶標(biāo)板后待用。

10：【測(cè)定讀數(shù)】：酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，以空白孔調(diào)零450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）

測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。